细胞凋亡实验（流式法)

一、技术简介

       细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡是一种特殊的细胞死亡类型，具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。凋亡是多基因严格控制的过程。

      Annexin V/PI双染检测细胞润亡∶在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸PS)只分布在细胞膜脂质双层的内则，而在细胞凋亡早期，细胞腰中的碟脂醋丝氨酸(PS)由脂膜内见翻向外侧。Annexin V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酚丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin VI被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin进行荧光素标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘比丙定(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与Pl匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

二、实验流程

1. 把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液(可含有EDTA)消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。
2. 加入步骤2a中收集的细胞培养液，把细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。注意：加入步骤2a中的细胞培养液非常重要，一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-FITC，导致染色失败。
3. 取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。
4. 加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。
5. 加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀。
6. 室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中。可以使用铝箔进行避光。孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染色效果。
7. 如果用于流式细胞仪检测，可立即上机检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，碘化丙啶(PI)为红色荧光。

三、结果展示

四、服务流程

五、服务说明及结果

1.客户提供:培养好的细胞以及所需药品。

2.公司提供:原始数据及分析结果、完整的实验报告。

3.实验周期:10个工作日，具体需要根据细胞生长情况及实验内容而定。