蛋白质免疫印迹（Western Blot）

一、技术简介

      外泌体(Exosome)主要检测指标为CD63、CD9、CD81、Tsg101、Alix等，针对外必体的定性检测，至少选择3个以上指标就能满足文章发表就可以。大部分文献中没有检测内参，个别文章中使用了Actin、GAPDH和Tubulin作为内参进行检测，外泌体中的Actin、GAPDH和Tubulin的表达丰度相对于正常细胞样品中的较低,可能会检测不到任何条带或者条带微弱。

本司有CD9、C081,CD63, HSP70,TSG101、 AliM、Calnexin抗体(优先建议CD9/HSP70/tsg101/Alix/Calnexin,CD63/CD81可选做)，专门用于外泌体WB检测。客户不用单独购买抗体，只需只收取抗体使用费400元/指标(8个样本内)。

二、实验流程

1. 蛋白样品制备

• 倒掉培养液，PBS 洗涤，弃净 PBS，加入裂解液，置于冰上或 4℃ 冰箱裂解 10min，用细胞刮刀及移液枪将细胞碎片及裂解液移至 1.5ml 离心管，继续裂解 20min。于 4℃ 离心机离心（14000 rpm，15min），取上清，置于 -20℃ 冰箱保存。

2. 蛋白含量的测定（BCA）

• 取出蛋白样品，置于冰上融化。配制 BCA 液（A:B=50:1），在 96 孔板上每孔加入 100 微升 BCA 液，加入 20 微升被试，每个样品重复 3 孔。避光 37℃ 30 min，于 562 nm测定，计算蛋白浓度。

3. 电泳

• 配制上样的样品，100℃ 金属浴 15min，上样，上 marker，60V 电泳，跑过浓缩胶后可加到 120V，跑至底层后可停止。

4. 转膜

• 取适宜大小的 PVDF 膜，浸泡在无水乙醇中 1 min 活化，移入转膜液中浸泡。

5. 封闭

• 膜浸泡于 5% 脱脂奶粉，于摇床上低速摇晃，封闭 2 h，弃去 5% 脱脂奶粉，以 TBST 于摇床上高速摇晃，洗涤 5 min，重复三次。

6. 一抗孵育

• 加入一抗，于 4℃ 冰箱孵育过夜。

7. 二抗孵育

• 回收一抗，TBST 洗涤 15 min，重复三次。加入对应的二抗，于摇床上常温孵育 2h，TBST 洗涤 15min，重复三次。

8. 显影

• 将显影 A 液和 B 液以 1:1 配制，将膜浸入显影液 5s 后，即可在曝光机上曝光。

  三、结果展示

  

四、服务流程

五、服务说明及结果

1.客户提供:外泌体或由我司分离外泌体。

2.公司提供:基本实验步骤、图片、数据分析结果。

3.实验周期:10个工作日。