Advanced Healthcare Materials：膜蛋白双阳性细胞外囊泡的分离富集及其后续生物学研究

选择合适的分离技术是进一步深入研究EVs生物学功能及其下游分析的重要基础。现有的EVs分离技术，包括超速离心、超滤和尺寸排阻（SEC）等，都是基于EVs的尺寸和密度等物理性质，没有选择性，这在一定程度上限制了EVs生物学功能的探索。一些研究报道，抗体和适配体修饰的磁珠或新材料可以提供反应界面，可以实现特异蛋白阳性EVs亚群的分离。然而，它们都是基于单一阳性参数，不可避免地会受到可溶性游离蛋白、脂蛋白和EVs碎片的影响。因此，实现EV特异亚群的多参数分离和富集仍然具有一定的挑战性。

近日，南方医科大学南方医院郑磊教授与李博副教授课题组在Advanced Healthcare Materials杂志上发表了题为“Isolation and enrichment of extracellular vesicles with double-positive membrane protein for subsequent biological studies”的学术论文(2023 Nov 9:e2303430)，报道了一种基于邻位连接（Proximity Ligation Assay, PLA）的膜蛋白双阳性EVs分离富集新技术，并在下游EVs生物学功能探索、标志物筛选和癌症诊断方面进行了初步应用。

邻位连接（PLA）是通过构建一对抗体-DNA偶联物，将蛋白质信息转化为核酸检测信号的一种特殊的免疫分析方法。当两种抗体-DNA偶联物识别同一靶蛋白的不同表位时，核酸探针之间的距离非常接近，产生所谓的接近效应，被广泛地应用于血液和其他体液中微量蛋白的检测。在这项工作中，作者以PLA为技术核心，通过两个抗体核酸复合物特异性的靶向EVs膜蛋白标志物，再引入连接两个抗体核酸复合物的RNA链形成DNA-RNA复合体，实现EVs双阳性膜蛋白的捆绑，然后通过偶联了DNA-RNA复合体抗体的免疫磁珠特异性地捕获DNA-RNA复合体实现膜蛋白双阳性EVs亚群的分离，最后通过酶切核酸链实现膜蛋白双阳EVs亚群的富集（图1）。

 图 1：膜蛋白双阳性细胞外囊泡的分离富集技术原理图

研究发现，该方法的捕获效率可达到约83.87%，每个磁珠平均可提供约1425个EVs捕获位点，有利于膜蛋白双阳行EVs亚群的大规模分离富集。此外，该方法在一定程度上避免了可溶性蛋白的干扰，具有良好的特异性（图2）。为进一步探究膜蛋白双阳性EVs亚群的生物学功能，研究者分离富集的特异EVs亚群可进一步被用于细胞摄取研究、高通量小RNA测序和乳腺癌诊断。总的来说，膜蛋白双阳性细胞外囊泡的分离富集技术为特定EVs亚群的分离富集及后续促进EVs基础和临床研究的发展提供了新的研究策略。

图2：膜蛋白双阳性细胞外囊泡的分离富集技术性能评价

南方医科大学南方医院郑磊教授和李博副教授为论文的共同通讯作者。南方医科大学南方医院刘春辰博士、林慧娴博士和于海洋硕士为论文的共同第一作者。

参考文献：

Isolation and enrichment of extracellular vesicles with double-positive membrane protein for subsequent biological studies, Adv. Healthc. Mater. 2023 Nov 9:e2303430. doi: 10.1002/adhm.202303430.

（文章转自 外泌体资讯网 ）